I-Cre I

I-CreI es un homing endonuclease cuyo gene se descubrió primero en el genoma chloroplast de Chlamydomonas reinhardtii, una especie de algas verdes unicelulares. Se llama para los hechos que: reside en Intron; se aisló de Clamydomonas reinhardtii; era el primero ('I) tal gene aislado de C. reinhardtii. De manera interesante, su gene reside en un grupo I intron en los 23 ribosomal gene del ARN del C. reinhardtii chloroplast, e I-CreI sólo se expresa cuando su mRNA se empalma de la transcripción primaria del gene de 23. La enzima de I-CreI, que funciona como un homodimer, reconoce una secuencia 22-nucleotide del ADN doble e hiende una obligación phosphodiester en cada hilo en posiciones específicas. I-CreI es un miembro de la familia LAGLIDADG de homing endonucleases, todos de los cuales tienen un adorno del aminoácido LAGLIDADG conservado que contribuye a sus esferas asociativas y sitios activos. Cuando I-CreI-containing intron encuentra un gene de 23 que carece del intron, enzima de I-CreI "casas" en en "el intron-menos" allele de 23 y efectúa la introducción de su intron paternal en el intron-menos allele. Introns con este comportamiento se llaman introns móvil. Como I-CreI asegura su propia propagación no confiriendo ninguna ventaja a su anfitrión, es un ejemplo del ADN egoísta.

Descubrimiento

I-CreI se observó primero como una secuencia intermedia en los 23 rRNA el gene del C. reinhardtii chloroplast genoma. El gene de 23 es un gene del ARN, significando que su transcripción no se traduce a la proteína. Como el ARN, forma la parte de la subunidad grande del ribosome. Una codificación del marco de lectura abierta para una proteína de 163 aminoácidos se encontró en esto 23 intron, sugiriendo que una proteína podría facilitar el comportamiento homing de intron móvil. Además, la proteína predita tenía un adorno LAGLIDADG, una secuencia de aminoácidos conservada que está presente en otras proteínas cifradas para en el grupo I introns móviles. Un estudio de 1991 estableció que el ORF cifra para un ADN endonuclease, I-CreI, que selectivamente corta un sitio correspondiente a donde el intron se empalma de los 23 transcripción primaria. El estudio también mostró que el intron era capaz de invadir 23 alleles que no lo tenía ya.

Mecanismo de propagación

I-CreI ha evolucionado para cortar una secuencia 22-nucleotide del ADN que ocurre en alleles de los 23 ribosomal el gene del ARN que carecen de I-CreI-containing intron. Cuando tal "intron-menos" el allele se corta, los caminos de la reparación de la ruptura del doble hilo se activan en la célula. La célula usa como una plantilla para la reparación los 23 allele que cedió la enzima I-CreI responsable, así reproduciendo I-CreI-containing intron. Resultar "intron-más" allele ya no contiene un sitio homing intacto para la enzima I-CreI y por lo tanto no se hiende. Ya que este intron asegura su propia réplica sin conferir cualquier ventaja a su anfitrión, I-CreI es una forma del ADN egoísta.

Estudios estructurales y aplicaciones posibles

Como I-CreI ha evolucionado para cortar una secuencia tan larga del ADN, a diferencia de la restricción endonucleases que típicamente cortan cuatro - o secuencias seis-nucleotide, es capaz de cortar un sitio solo dentro de un genoma muy grande. Se espera que unos cuatro - o secuencia seis-nucleotide ocurran muchos, muchas veces en un genoma de millones o mil millones de nucleotides simplemente por casualidad, mientras que una secuencia 22-nucleotide sólo podría ocurrir una vez (10/4 contra 10/4). Esta precisión de la hendidura I-CreI hace I-CreI un instrumento prometedor para el apuntamiento de genes. Si una persona debiera tener una enfermedad debido a allele defectuoso de algún gene, sería provechoso ser capaz de sustituir esto allele por uno funcional. Si uno pudiera hacer que I-CreI cortara el ADN sólo en allele defectuoso proporcionando simultáneamente allele normal a la célula para usar como una plantilla de reparación, la propia maquinaria de la nueva combinación homóloga del paciente podría insertar allele deseado en el lugar del disfuncional. La precisión de I-CreI también tiene la reducción en cuenta de efectos deletéreos debido a rupturas del doble hilo fuera del gene de interés.

A fin de usar I-CreI como un instrumento de esta moda, es necesario hacerlo reconocer y hender secuencias del ADN diferente de su sitio web homing natal. Escherichia coli sistema genético para estudiar la relación entre la estructura I-CreI y su precisión del sitio homing se creó en 1997. En 1997, la estructura de la proteína I-CreI se determinó, y en 1998, su estructura de cristal ligada a su ADN natal homing sitio se solucionó, enormemente ayudando a la investigación en el cambio del reconocimiento del sitio homing de la proteína. Las formas del mutante de la proteína se han desde entonces creado que el objeto expuesto cambió la precisión del sitio homing. Un sistema genético en Saccharomyces cerevisiae también se ha creado, mutantes I-CreI adicionales flexibles con precisiones del sitio homing modificadas.

I-CreI se ha usado ya con éxito para inducir la nueva combinación homóloga en Drosophila melanogaster, un organismo modelo eucariótico muy popular. Parece muy probable que los avances en técnicas biológicas moleculares y generación de una biblioteca de la novela I-CreI-derived endonucleases tendrán finalmente el apuntamiento en cuenta de muchos genes del significado etiological.



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